百问百答 | 细胞有小黑点，是碎片还是污染？

细胞内黑点：首先需要明确的是，细胞内的黑色颗粒既不是碎片也不是污染，是细胞器及细胞外分泌泡，属于细胞自身的结构及特性。不同类型的细胞，胞内颗粒的数量可能不同。培养条件也会影响细胞内颗粒的数量。

▲ 细胞内黑色颗粒为自身结构特性

细胞外黑点：通常为细胞碎片、细胞代谢产物或血清中的磷酸钙沉淀（此文中统称为碎片），常常与污染混淆。

最常见的微生物污染为细菌、真菌、支原体污染。真菌与碎片差别很大，真菌通常为白色圆球状或白色菌丝状，碎片是小黑点，不难区分。

▲ 真菌污染的两种典型特征

而支原体用光学显微镜是看不见的，必须要用PCR等实验手段进行检测。在此不做赘述。

然而，细菌（特别是球状细菌）与碎片却极为相似，显微镜下呈现为小黑点，分布于细胞周围。区分细菌和碎片则是此文的重点。

4倍或10倍物镜观察，可以初步判断黑点分布情况，但看不清形态，不容易判断。所以我们首先要将物镜调到20或40倍，再进一步观察黑点的特征。主要从三个方面来判断：1. 形态特点 2. 运动方式 3. 是否增殖。

● 看形态

碎片通常是不规则的，有圆形有多边形，大小不一，分布不均匀。细菌形态规则，呈杆状、球状或线状，具有高度重复性，分布较为均匀。

● 看运动

碎片可分为贴壁或悬浮两种状态：贴壁的碎片不会自主运动，而悬浮的细胞碎片会随液体轻微震动或缓慢飘动（越小的碎片越容易震动，震动频率越高）。

细胞碎片或分泌物是细胞在培养过程中产生的，正常培养过程中细胞代谢和死亡无可避免，大多细胞系都会有类似情况，只是不同细胞系碎片颗粒多少会有区别。颗粒会动是基于高中时期所学基本物理原理-布朗运动，根据其他细胞库细胞照片情况，只要拍摄比较清晰的，都可以看到细胞外黑色颗粒,这些碎片只要是悬浮在液体里都会做布朗运动。JCRB细胞库延时摄影信息可以更明显观测到碎片位置变化，是布朗运动的时间积累结果。

▲ 细胞生长延时摄影（来源：JCRB细胞库）

细菌不会贴壁，无鞭毛的细菌不会运动；有鞭毛的细菌会定向游动、原地打转、震动，细菌这几种运动方式经常是同时存在的。细菌相比于碎片，运动速度要快得多，运动幅度也会更大。

▲ 碎片随着液体轻微震动

▲ 细菌快速运动

● 看增殖

碎片不会增殖，但细胞逐渐死亡或细胞密度增大，碎片都会逐渐增多。随着培养时间延长，培养基中的血清也会缓慢析出沉淀，导致黑点变多。但培养基不会浑浊。

现在我们大部分时候培养细胞都会加1%青链霉素双抗（也称为P/S）预防细菌污染，然而有一些细菌不在P/S抗菌谱中，一旦落入培养基就会开始增殖。

大部分细菌会在1-2天内爆发式生长，导致培养基浑浊，肉眼可见流沙状物质。

也有少数种类细菌会受到双抗的影响，增殖速度没那么快。当比较难判断的时候，我们可以使用不含双抗的培养基过夜培养，观察黑点的增殖情况。

▲ 细菌污染导致培养基浑浊

如果通过以上三种方法还是难以判断，还有一招——将培养上清涂布细菌培养平板进行验证：取细胞培养上清，无菌环境下涂布细菌专用的固体培养基平板，置于生化培养箱培养24-72h，观察是否产生菌落。此方法更准确，但要求实验室有微生物培养设备和材料，同学们可以根据自己的实际情况选择合适的方法。

▲ LB平板菌检（左：阳性 右：阴性）

总之，面对细胞中的小黑点，我们无需过分恐慌。只要我们深入了解细胞碎片与微生物污染的特征，并掌握正确的判断方法，便能轻松应对。