手把手教学！慢病毒转染实操超全攻略来了!

慢病毒的实验流程大致分为：质粒构建—病毒包装—病毒收集与浓缩—感染靶细胞—筛选与验证

构建重组质粒，将外源目的基因片段插入质粒载体，得到重组质粒，在大肠杆菌内转化，并抽提得到重组质粒DNA。

将重组质粒DNA和其他包装质粒按照说明书的一定比例一起共转染293T细胞，48小时、72小时分别收获含病毒的上清。

收集的含病毒上清3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。将上清继续12000转离心初步浓缩、分装-80°C贮存。必要时滴度测定目的基因检定。超速离心法及PEG沉淀法均可有效浓缩病毒，但前者设备要求高；后者虽操作简便，成本低，但效率稍低。

以293T细胞为例，将状态良好的目的细胞消化收集，通过细胞计数，调节细胞密度至1x10⁵个/mL，接种到24孔板，每孔加0.5mL，混匀后放37℃，5%CO2培养箱培养。由于不同细胞的生长速度不同，细胞接种量也会有所不同。一般保证接种的第二天进行感染时细胞汇合度在30%-50%即可。 

观察293T细胞生长情况，吸去24孔板内细胞中的旧培养基，加入提前预热的新鲜完Q培养液，每孔0.25mL，放37℃，5%CO2培养箱培养4小时。注意动作轻柔，以免吸走细胞或者将细胞吹起漂浮。4小时后每孔补加0.25mL新鲜完Q培养液，继续培养。注意：部分孔不加病毒，作为对照组。

转染后第二天，也就是加病毒24小时，显微镜下观察细胞状态是否有异常，并记录，无异常的情况下吸去24孔板内含有B毒的培养液，补加新鲜的完Q培养液继续培养。

若转染了带荧光基团的慢病毒，可以在转染后48小时通过倒置荧光显微镜检测其荧光强度从而初步检测转染效果。也可以在此时加入适宜浓度的puromycin或其他筛选药物筛选出成功转染的细胞。注意：对于生长缓慢的细胞，可以延长观察时间至96小时。

（1）病毒的保存适当：病毒短期可存放4℃冰箱保持（不超过一周），长期保存需分装后-80℃冰箱存放不超过6个月，使用时冰上融化，避免反复冻融而影响病毒活性。超过6个月，病毒滴度有可能降低。

（2）细胞状态：选择生长对数期的细胞进行转染，细胞活性好，有利于提高细胞转染效率。

（3）细胞接种量：根据细胞的增殖速度和接种的培养器皿决定，细胞接种密度需要适宜，传代周期在2-3天的，转染前密度在30%-50%。生长缓慢的细胞系或者新利18快乐彩，转染前密度约在90%左右。

（4）MOI值：通常MOI值越高，细胞越难转染，转染前细胞需要计数，计算细胞接种量。加入病毒的体积(uL)=MOI值X细胞接种量/病毒滴度（Tu/mL）X1000。

（5）实验前需要查找文献资料，需要靶细胞的培养条件、生长速度、生长形态、MOI值、宿主细胞筛选药物致死浓度等参数，优化转染条件。

（6）细胞转染前后，需要观察细胞状态，转染后，若细胞状态不佳，可以先不加药筛选，调整细胞状态，带状态好转后再筛选。若转染48小时后，细胞密度较大，可传代后待细胞贴壁或稳定后加药筛选处理。

（7）转染效率的观察时间，一般是转染48小时-72小时观察，对于有些增殖缓慢的细胞，可以延长观察时间至96小时甚至更长。

转染过程中，多种因素会影响慢病毒对细胞的感染效率，如细胞自身生长状态、细胞接种数量、细胞被慢病毒感染的难易程度(MOI)等，因此保证细胞状态良好，细胞密度适中感染条件适宜，可以达到更好的感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心，去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置15 min(尽量不要超过30 min),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜即可。

转染过程中，多种因素会影响慢病毒对细胞的感染效率，如细胞自身生长状态、细胞接种数量、细胞被慢病毒感染的难易程度(MOI)等，因此保证细胞状态良好，细胞密度适中感染条件适宜，可以达到更好的感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心，去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置15 min(尽量不要超过30 min),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜即可。

不论是瞬转还是稳转，DNA都会入核并有一定概率随机整合到宿主染色体；区别在于，稳转所用的质粒含有抗性基因，后期可以通过药物筛选，把没有转进目的基因的细胞杀死，筛选出成功转入目的基因的细胞，并可以传代遗传。而瞬时转染由于没有药物加压筛选，加上仅有少量的细胞中有目的基因整合到染色体，所以传代后，阳性细胞会越来越少，导致目的基因表达量逐渐降低，进而不能长期稳定表达。

根据细胞增殖的速度以及接种培养容器大小来调整细胞接种量，以保证在感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。对大部分细胞系传代周期在2~3天，感染前细胞铺板的密度保持在20%~30%左右；对于某些新利18快乐彩，可以在接种时提高汇合度到50%~60%；对于终末分裂细胞，如神经元细胞，心肌细胞等，可以按照90%的汇合度进行接种